Il sequenziamento del DNA serve a stabilire, con precisione, l’ordine delle basi in un frammento di informazione genetica. Conoscere l’esatta sequenza delle basi è di fondamentale importanza per tutti i modelli di ricerca in biologia molecolare poiché rende possibile stabilire la presenza di mutazioni, la struttura primaria dei geni, la localizzazione di specifici elementi (promotori, terminatori, sequenze satelliti) e via dicendo.
Sequenziamento manuale del DNA
I primi esperimenti di sequenziamento erano effettuati con l’ausilio di tecniche esclusivamente manuali. L’idea di base era semplice e, allo stesso tempo, efficace. Il DNA estratto veniva clonato più volte ed inserito in quattro provette differenti. In ognuna di queste provette vengono inserite i nucleotidi deossitrifosfato ed una aliquota di nucleotidi dideossitrifosfato che, rispetto ai primi, mancano di un ossigeno nello zucchero pentoso. Inoltre viene inserito una molecola marcata mediante la quale è possibile tenere traccia della sequenza. La polimerasi allunga la catena usando i nucleotidi deossitrifosfato e, casualmente, aggiunge un nucleotide deossitrifosfato che fa terminare la catena poiché la polimerasi non è capace di procedere ulteriormente.
L’inserzione è di tipo casuale per cui, in ogni tubo, si formano una serie di frammenti più o meno allungati che possono essere distribuiti in base alla loro dimensione mediante corsa elettroforetica su un gel particolarmente sensibile. Le lastre vengono quindi “fotografate” e i punti di radioattività, corrispondenti ai vari segmenti, vengono individuati grazie a dei punti nella fotografia. Affiancando i quattro risultati è possibile stabilire la sequenza nucleotidica proprio perché ognuna delle quattro corsie corrisponde ad uno specifico nucleotide.
Sequenziamento automatico del DNA
Il sequenziamento manuale del DNA ha un inconveniente: è estremamente lento e necessita di una figura che supervisioni e trascriva la sequenza. Per velocizzare il processo si è perfezionato un sistema di lettura automatico che prevede l’utilizzo di nucleotidi trattati in modo da restituire una determinata lunghezza d’onda quando eccitati da una luce laser. In altre parole ogni base restituisce una specifica lunghezza d’onda che può essere rilevata da appositi strumenti.
Le macchine sequenziatrici possono operare letture estremamente rapide permettendo il sequenziamento di genomi in tempi compatibili con la ricerca scientifica. Inoltre l’utilizzo di sostanze non radioattive elimina ogni potenziale pericolo di contaminazione e rende più semplice il protocollo di sequenziamento.