Le esonucleasi sono nucleasi che attaccano le estremità della molecola e digeriscono un nucleotide per volta a differenza delle endonucleasi che tagliano un segmento di DNA all’interno. Una esonucleasi caratteristica è la Bal31, estratta dal batterio Pseudomonas-Altermonas che, pur preferendo substrati a singolo filamento, è capace di tagliare le estremità 3′ e 5′ di tipo duplex, probabilmente a causa del non perfetto appaiamento delle basi a quei livelli.
Bal31 è di prima scelta quando si necessita di accorciare un duplex. Le esonucleasi, in aggiunta, possono operare il taglio soltanto dall’estremità 3′, soltanto dall’estremità 5′ oppure indifferentemente da ambedue estremità.
